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    辣椒素生物合成关键基因AT3的克隆表达及调控机制研究

    2.在 C.chinese 类型辣椒中 AT3 启动子比其他两种类型辣椒中 AT3 启动子多一段 10bp 的碱基片段,在 CAAT-box、TATA-box、TCT-motif 三种作用元件上与其他两种类型辣椒的 AT3 启动子存在数量上的差异。3. 转录因子 CAJMYB、CAFMYB、CADMYB 都在辣椒果实中有着较高的表达量。4. 转录因子 CAJMYB 与 CADMYB 可以通过诱导 AT3 的表达来调控辣椒素的生物合成。5.外源激素 SA、MeJA、BR 可以通过提高 CAJMYB 与 CADMYB 的表达量辣调控辣椒素的生物合成,且 C.anuum 类型的辣椒对 MeJA、BR、H3BO3 及的处理更敏感。6. 外源激素 H3BO3 可以通过直接或间接的方式诱导 AT3 的表达来调控辣椒素的生物合成。 第 1 章 前言 1.1 辣椒素 辣椒(Capsicum spp.),是茄科辣椒属一年生或多年生草本植物,明朝末年,由南美洲热带地区传入中国,辣椒传入中国由两条途径,其一经陆上丝绸之路流入我国甘肃、陕西等地,时称秦椒,另外则经海上丝绸之路由马六甲海峡登陆我国了两广及云南等地[1],逐渐被人们传播种植,因其辛辣的风味广受人们的喜爱,现在不少地区已是“无椒芥不下箸也,汤则多有之”[2],可见辣椒在我国的受欢迎程度。据报道,我国辣椒年产量可达到 4000 万吨,是居世界之首的辣椒生产、消费大国[3]。 辣椒素(Capsaicinoid)是导致辣椒辛辣的原因,是辣椒属特有的次生代谢物质,辣椒素是一种生物碱[4],存在于辣椒的胎盘中,它的存在可以保护辣椒种子不受真菌、细菌和一些哺乳动物的侵害,另外,无法感知辣味的禽类食用其种子后,随自身行动将其种子传播,有利于辣椒的物种繁殖[5]。除了以上天然功能外,辣椒素还在食用、医疗保健、生物防治等方面有着重要的应用价值[6]:作为食品添加剂,从辣椒中提取分离出辣椒素,将其添加到食品如辣椒酱的加工过程中,有利于对食品辣度的控制和辣椒素的充分吸收利用[7];作为医疗保健品,辣椒素具有消炎、镇痛的功效,其镇痛作用甚至好于吗啡,对治疗糖尿病神经痛、风湿性关节炎、皮肤病等有显著功效[8],另外有最新研究表明,辣椒素还可抑制恶性肿瘤的发生、预防心血管疾病、降低有害胆固醇水平、治疗肌肉萎缩[9];作为生物防治材料,辣椒素还可以作为一种海洋防污涂料驱赶海藻、贝类等海洋附着生物,作为电线电缆中的忌避剂驱赶白蚁老鼠和野兔[10]。有些国家还将辣椒素作为生产催泪弹的原材料[11]。.............................. 1.2 辣椒素工业生产现状 深厚的原料优势和广阔的应用前景决定了辣椒素在我国具有极高的工业生产价值。但是目前,我国的辣椒素工业生产在进行了传统工艺手法改良和规模化的集合创新之后,仍存在生产成本过高、产量无法满足国际市场需求等问题[12],主要因为工业生产所用的辣椒品种中辣椒素含量过低[13],因此对辣椒素的生物合成途径进行研究,改良其果实性状,对提高辣椒素的工业生产效率,具有重要的现实意义。辣椒属的种质资源十分丰富,目前世界上已经被人类栽培驯化的品种共有 5种[14],分别是中国辣椒( C. chinense)、一年生辣椒( C. annuum)、灌木辣椒( C. frutescens)、茸毛辣椒(C.pubescens)、下垂辣椒(C. baccatum),我国长期栽培和种植一年生辣椒、中国辣椒和灌木辣椒 3 个品种[15],如表 1.1 所示,不同栽培种辣椒具有不同的特性,每个栽培种都拥有大量的优异基因,其中一年生辣椒被广泛种植和应用于辣椒素的工业生产,其余四个品种则是改良它的重要资源。 ............................. 第 2 章 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 植物材料 一年生辣椒(C.annuum):伏地尖、紫辣妹、红心、群羊、朝天椒。 灌木辣椒(C.frutescen):小米辣。 中国辣椒(C.chinense):魔鬼椒、黄灯笼椒。 以上辣椒材料均种植于吉林大学和平校区农业试验站的温室大棚中,其中大棚相对湿度 40%英语翻译论文,昼夜温度分别为 28℃和 20℃ 。 2.1.2 载体与菌种 pMD18-T 载体如图 2.1,购自宝日医生物技术有限公司。 .......................... 2.2 实验方法 2.2.1 实验试剂与培养基的配置 LB 液体培养基:称取 Yeast Extract0.5g、Tryptone 1g、Na Cl1g,用蒸馏水定容至 100ml,放入高压灭菌锅中灭菌。 LB 固体培养基:称取 Yeast Extract0.5g、Tryptone 1g、Na Cl1g 加入、Agar1.5g,用蒸馏水定容至 100mL日记,放入高压灭菌锅中灭菌,灭菌后加入对应的抗生素倒板备用。 SA 外源激素:称取 0.104g 水杨酸,蒸馏水定容至 500mL,终浓度 1.5mM。 MeJA 外源激素:称取 0.26g 茉莉酸甲酯,蒸馏水定容至 500mL,终浓度2.5mM。 BR 外源激素:称取 0.24mg 油菜素内酯,蒸馏水定容至 500ml,终浓度 0.1μM。 SA+ MeJA 外源激素:称取 0.104g 水杨酸、0.26g 茉莉酸甲酯,蒸馏水定容至 500mL。 H3BO3:称取 0.5g 纯硼酸粉末,蒸馏水定容至 500ml,终浓度 1.5mM。 ......................... 第 3 章 结果与分析............................ 24 3.1 不同栽培种辣椒 AT3 基因克隆及生物信息学分析...............24 3.1.1 不同栽培种辣椒 AT3 基因 m RNA 克隆及测序........... 24 3.1.2 不同栽培种辣椒 AT3 基因生物信息学分析..................25 第 4 章 讨论.......................52 第 5 章 结论.............................. 56 第 4 章 讨论 我国一直是辣椒的生产大国,但是由于高辣度辣椒品种作为短日照植物难以在我国进行大面积种植,并且通过常规的杂交育种很难获得高产高辣的辣椒品种,因此工业生产辣椒素的效率受到一定的影响英语翻译论文,故挖掘辣椒中高辣基因及其表达调控机制,具有一定的生产指导价值。辣椒素的合成受自身遗传与外界环境多方面因素的影响,研究表明,不同种辣椒间辣椒素生物合成路线相同,参与合成的基因种类相同[54],但是不同品种间的某个关键基因在碱基水平上或者上游调控元件上都可能存在差异,且大部分的外界环境例如外源激素、干旱胁迫、光照等都是通过改变辣椒内部相关基因的表达情况来调控辣椒素的生物合成[55],所以研究辣椒素合成的关键基因 AT3 其自身在不同辣度辣椒品种间存在的差异及其表达受到何种因素的调控是改良辣椒品种辣度的一条重要思路。 本研究所用辣椒品种主要有伏地尖、紫辣妹、红心、群羊、朝天椒、小米辣、印度魔鬼椒、海南黄灯笼椒等,分属于一年生辣椒、灌木辣椒、中国辣椒三个栽培种,其生理生化特征表现出典型的品种特征,得出的实验结果也具有一定代表性,但同时,因为一年生类型辣椒在我国种植范围广、品种类型多、种质资源十分丰富,故本实验结果在一年生辣椒品种中是否普遍适用还需进一步实验验证。 本研究对三种不同辣度的辣椒中辣椒素生物合成关键基因 AT3 在碱基水平、氨基酸水平及上游启动子水平上进行了比对分析结果发现三种辣椒中 AT3 基因及其启动子在结构上并不存在明显的差异、在氨基酸的各种功能性质上也没有明显的不同,但需要注意的是魔鬼椒 AT3 基因的启动子中多出一段 10bp 左右的碱基片段,在这一片段上虽然不存在顺式作用元件,但可能使魔鬼椒 AT3 基因启动子序列上多出一段可能性为 0.81 的基础启动子序列,另外魔鬼椒中 CAAT-box、TATA-box 的数量与另外两种辣椒不同,这两个盒都是参与基因转录表达的英语翻译论文,另外魔鬼椒中还存在一个特有的参与光反应的顺式作用元件 TCT-motif,这或许可以解释为何不同辣椒在同样的光照条件下产生不同的辣度,这些也是今后研究的一个方向,即将含有特殊元件的启动子片段缺失转化到具有报告基因的表达载体中,进行表达分析。 ............................ 第 5 章 结论 1.不同栽培种辣椒中 AT3 基因在碱基水平、氨基酸水平及功能上不存在明显差异。 2.在 C.chinese 类型辣椒中 AT3 启动子比其他两种类型辣椒中 AT3 启动子多一段 10bp 的碱基片段,在 CAAT-box、TATA-box、TCT-motif 三种作用元件上与其他两种类型辣椒的 AT3 启动子存在数量上的差异。 3. 转录因子 CAJMYB、CAFMYB、CADMYB 都在辣椒果实中有着较高的表达量。 4. 转录因子 CAJMYB 与 CADMYB 可以通过诱导 AT3 的表达来调控辣椒素的生物合成。 5.外源激素 SA、MeJA、BR 可以通过提高 CAJMYB 与 CADMYB 的表达量辣调控辣椒素的生物合成,且 C.anuum 类型的辣椒对 MeJA、BR、H3BO3 及的处理更敏感。 6. 外源激素 H3BO3 可以通过直接或间接的方式诱导 AT3 的表达来调控辣椒素的生物合成。 参考文献(略)
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